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ELISA試劑盒方法與硝酸纖維素膜微粒介紹

2015-03-17 [1923]

1 實驗方法

1.1 混合抗原直接測試 
按豚鼠膜迷路蛋白抗原性分析文章講述的方法[1],將1.2ml大鼠原血清加入7.0ml10%丙烯酰胺溶液,聚合后在10°C、200mA、2h條件下大鼠血清蛋白電泳吸附于NC膜,用蒸餾水漂洗后,切一10×100mm小條裝入10ml試管備用。對照組將同樣面積空白NC膜用蒸餾水漂洗后備用。ELISA試劑盒在上述裝有NC膜的試管中加入10ml DMSO,充分搖勻,室溫1h;加入等體積0.1mol/L pH9.0碳酸氫鈉溶液,充分混勻。3000r/min離心3~5min,收集沉淀,即為含大鼠血清蛋白的NC膜微粒,用0.01mol/L pH7.4 PBS-T洗滌離心3×5min;用含0.3%的1:50正常羊血清封閉、阻斷37°C30min或4°C冰箱;同上離心后用PBS將微粒體積調(diào)至5ml、用0.5ml離心管分裝,每管加入100μl微粒懸濁液;在各管中分別加入100μl倍比稀釋的HRP-羊抗鼠,37°C孵育30min;同上洗滌離心3次,加入100μl含0.1mol/L檸檬酸、0.2mol/L磷酸氫二鈉、雙氧水、鄰苯二胺底物溶液,于37°C暗環(huán)境反應(yīng)120min;每管加入1滴2mol/L硫酸終止反應(yīng),同上離心,收集上清并加入96孔ELISA試劑盒酶聯(lián)板,用酶標儀測試波長490nm處OD值。重復(fù)測試3次。

1.2 電泳分離抗原測試 
首先免疫轉(zhuǎn)印鑒定抗原,ELISA試劑盒再根據(jù)免疫轉(zhuǎn)印結(jié)果進行定位,將特定抗原帶裁下,測量NC膜面積,同上將NC膜微?;幚聿⑦M行定量免疫測試。

2 實驗結(jié)果

用混合抗原直接測試和用電泳分離抗原進行測試,抗體濃度與OD值間均有較好線性關(guān)系,當抗體濃度為0.25~1.0ng/ml時線性,且陽性組和陰性對照組OD值落在*范圍(見表1),即陰性對照組OD值為0.3左右,陽性對照組為1.0左右。3次重復(fù)結(jié)果一致。
3 討論
用ELISA法進行測試時,包被條件非常關(guān)鍵,對用于包被的抗原或抗體要求較高,其應(yīng)用范圍受限制。NC膜具有很強的吸附能力,從而出現(xiàn)了以該材料為基礎(chǔ)的斑點免疫檢測法[2~4]。其對被吸附的抗原要求不高,粗制抗原便可用于檢測,但吸附時間長、費時,被吸附抗原如果含有表面活性劑便不能用于檢測。為了克服上述缺點,我們曾建立了一種電泳吸附斑點免疫法[1],但該法需要將NC膜逐一截成小圓片放入酶聯(lián)板中,操作也不方便,定量不夠準確。NCMPE法將電泳吸附抗原的NC膜變成微顆粒,分裝方便,能保證其均一性,定量準確,由于在離心管中操作、洗滌等處理極為方便。免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)是抗原抗體檢測方面的重大突破,但應(yīng)用該方法難以將抗體定量。NCMPE法將免疫轉(zhuǎn)印識別的特定抗原帶處理成微顆粒,然后用ELISA試劑盒法定量測試抗體水平,充分發(fā)揮了免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)的高分辨率和ELISA定量法的高度性與高度靈敏性,可極為方便而準確地將某種未知抗體定量。

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